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免疫荧光染色

 

一、实验原理

 

1、免疫组化（Immunohistochemistry）原理：应用免疫学基本原理，抗原与抗体特异性结合，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，以确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

 

2、分类：按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。

 

3、免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）：将已知抗体标上荧光素，作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察，当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光，以确定细胞或组织中的抗原定位或定量。

 

4、免疫荧光常见染料

 

颜色	染料	简介
蓝光	DAPI、Hoechst	可用于普通细胞核染色或细胞凋亡检测
红光	CY3、Rhodamine	激发波长550nm,发射波长570nm
绿光	CoraLite488、FITC	激发波长488nm，发射波长515nm；激发波长492nm，发射波长520nm
远红	Alexa Fluor 647	激发波长651nm，发射波长667nm

 

*示例图：

（左图）IF常规：荧光单标，DAPI蓝+PCNA红；（右图）IF常规：荧光异源双标，DAPI蓝+eNOS红+GFAP绿

1）适用样本：石蜡切片、细胞、冰冻切片

2）简介：免疫荧光单标、双标（2个抗体异源），可选择标记红光或绿光，默认DAPI染核呈蓝光。

 

（左图）IF同源双标：DAPI蓝+GFAP绿+KAP1红；（右图）IF同源双标：DAPI蓝+α-SMA绿+KAP1红

1）适用样本：石蜡切片（质量较好不易掉片的样本）

2）简介：TYR-488绿光、TYR-CY3红光两种反应液所染荧光比常规荧光二抗更亮、更强。

 

二、实验步骤

 

1、IF（石蜡切片）常规主要染色步骤：

（注：孵育二抗选择CY3、Rhodamine、CoraLite488、FITC等荧光染料标记的二抗）

 

2、IF（石蜡切片）同源双标主要染色步骤：

 

*IF同源双标实验原理简介：

酪胺信号放大技术（TSA，Tyramide signal amplification），利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行高密度原位标记，提高检测的灵敏度，大幅提高信噪比。TSA信号不受微波法影响，并能在抗体去除后保留信号的原理。通过顺序染色，进行各色标记，先通过微波加热去除上一轮抗体，再进行下一轮染色检测，而不必担心上一波染色中抗体的干扰。因此，可以使用同一种属来源的一抗进行多色标记。每一轮染色换用不同颜色标记的TSA，可对切片质量较好的石蜡切片样本多重染色。

  

三、注意事项

 

1、样本固定：4%多聚甲醛PFA，适用于绝大多数细胞、组织的固定，穿透力强，固定均匀，能使组织硬化，有利于切片。但眼球样本，视网膜容易碎裂，结构特殊，最好使用专用的混合型固定液，尽量保持样本的完整性。

2、避光操作：因为荧光染料可能会淬灭，所以染色过程中，加一抗前面那些步骤可正常不避光操作，但如果开始配制荧光二抗染料、孵育、染核、镜检、封片拍照等，这些步骤就都需要避光进行操作，避免荧光减弱或淬灭。

3、通透处理：Triton X-100破膜液，作用原理是，可溶解细胞膜、核膜、细胞器膜上的脂质，使需要的抗体或大分子结构的物质进入胞浆、细胞核。

4、荧光染料的选择：红光染料一般荧光比较亮、效价高，会优先选择；绿光染料，488系列可能会比FITC更亮、效价更高。

5、自发荧光：苏丹黑B（Sudan Black B），配制成染液处理组织切片，可减弱组织样本中，比如红细胞，这种自发荧光，使荧光结果相对更有特异性。

6、荧光较弱：适当调整孵育条件，比如提高一抗浓度、延长一抗孵育时间、提高二抗浓度、更换不同荧光标记的二抗等等。

7、洗涤：吐温80（Tween80），非离子型去污剂，可与PBS缓冲液配合使用洗涤，在免疫荧光染色中减少杂质或渣滓。