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当涉及到正常的生命生长和发育过程时，细胞迁移是重要的功能之一。它在伤口愈合、胚胎发育和血管生成等许多生理过程中扮演着关键角色。此外，细胞迁移也与免疫反应及癌症转移等疾病有关。因此，细胞迁移的研究一直以来备受科研人员的关注与探索。今天我们就来讲讲细胞迁移研究中的常备技术——细胞划痕实验。   1. 实验原理 细胞划痕实验(cell wound healing assay)是一种用于评估细胞迁移能力的方法。在细胞单层上创建一个空白区域，称为“划痕”或“伤口”。划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域，导致划痕愈合。在细胞迁移过程中，通过延时显微镜定期捕获图像，测量不同时间点的划痕间距并计算差值，以评估细胞的迁移能力。     2. 操作步骤 01 实验准备 准备所需的细胞培养基和消毒液; 将培养皿/培养板在消毒柜或消毒器内灭菌处理; 使用紫外线灯或其他消毒方式对操作区域进行彻底消毒。 02 细胞培养： 培养所需的细胞株，在适当的培养条件下培养至合适的密度; 将细胞收获并进行适当的离心处理，得到单个细胞的悬浮液。 03 细胞划痕： 在消毒后的培养器皿内用标尺和标记笔描绘出划痕线，通常选择一个明显可见的标记点，以方便后续观察和测量; 使用一个尖端将细胞划过预先描绘的划痕线，以在培养皿/板上形成一个细胞划痕; 注意保持器皿的稳定和水平，以确保划痕线的质量和准确性。 04 洗涤细胞： 用洗涤液(PBS)轻轻洗涤3次，去除划痕线上的游离细胞; 注意不要过度冲洗，避免把划痕区域的细胞一并移除。 05 细胞培养和观察： 加入预先准备好的无血清培养基; 将培养皿/板放入恒温培养箱中，保持适宜的培养条件(37°C，5% CO2); 在预定的时间点取出培养皿/板，并用显微镜观察细胞在划痕区域的迁移情况; 使用摄影技术记录图像，以备后续定量分析或比较。 06 细胞迁移分析： 使用图像处理软件(Image J)进行图像分析，测量划痕区域内细胞迁移的距离和速度; 根据需要进行统计学分析和数据可视化，以获得相关结果和结论。   3. 实验常见问题及解决方案 Q: 细胞划痕线不均匀，线不直或宽度不一致 A: 使用专门的划痕装置 6 孔板来确保划痕的准确性。因为6孔板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个固定监测点，不作重复，误差也很小。 Q: 非特异性影响，除了细胞迁移，实验还发生了细胞增殖的变化 A: 如果连续监测 24 小时，需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素(1 μg/ml)处理一小时，抑制细胞的分裂，这样的结果就是细胞迁移的作用了。另外，使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。 Q: 细胞迁移之间的差异问题及细胞迁移速度 A: 在同一实验中，不同细胞的迁移速度和方式可能会有差异，这可能是由于细胞类型、培养条件以及实验操作等因素的影响。解决方案是在实验前筛选细胞系，确保使用相对一致的细胞群体进行实验。虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。

在肿瘤细胞功能实验中，常见的实验包括细胞增殖、迁移和侵袭等。本期重点学习【细胞克隆形成实验】，用于检测细胞的增殖能力。   01 实验原理 细胞克隆形成实验是一种重要的技术方法，用于评估细胞的增殖能力、侵袭性以及对杀伤因素的敏感性等。 当单个细胞在体外连续增殖达到6代以上时，其后代形成的细胞群体被称为集落或克隆。细胞克隆形成率即细胞接种存活率，是指接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活动的细胞。 克隆形成率反映了细胞群体的依赖性和增殖能力这两个重要特征。     02 实验目的 1）通过对细胞处理后在细胞培养板上的克隆形成能力来提示处理后细胞的增殖能力； 2）评价不同杀伤因素，如药物或基因等对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性； 3）评价在体内成瘤性，癌细胞不一定都可以在体内成瘤，但若体外克隆能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是模拟体内成瘤的体外实验。   03 克隆形成实验分类与流程       克隆形成依据采用的培养介质不同，分为平板克隆和软琼脂克隆两类。   ——平台克隆实验—— 6孔板 细胞处理：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，并重悬成细胞悬液，然后进行计数； 细胞接种：将确定数量的细胞接种到6孔板中的各实验组，每孔接种400-1,000个细胞； 培养观察：继续培养细胞至14天或大多数克隆中的细胞数超过50个，每隔3天更换培养基并观察细胞状态； 固定与染色：克隆完成后，拍照记录细胞形态，然后用PBS洗涤细胞，加入4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟，再次洗涤； 染色和拍照：加入结晶紫染液染色细胞10-20分钟，再次用PBS洗涤细胞，晾干后用数码相机进行拍照（整个板和每个孔分别拍照）。   平皿 细胞处理：取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，然后悬浮在完全培养基中备用； 细胞接种：每组细胞悬液按照梯度倍数稀释，每组分别接种100个细胞到含有10ml 37℃预温培养液的皿中，轻轻转动确保细胞均匀分散； 培养观察：将培养皿放置在37℃、5% CO2和饱和湿度的细胞培养箱中培养2-3周； 克隆观察：当出现肉眼可见的克隆时，停止培养。用PBS小心洗涤细胞2次； 固定和染色：加入适量的固定液固定细胞，然后用染色液染色； 洗涤和干燥：用流水缓慢洗去染色液，使细胞干燥； 克隆计数：在带网格的透明胶片上，用肉眼计数可见克隆，或在低倍显微镜下计数大于10个细胞的克隆数； 统计与分析：计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）*100%。   ——软琼脂克隆实验——       软琼脂克隆形成（Soft agar colony formation）又称为非锚定依赖性生长实验(Anchorage-independent assay)，利用软琼脂作为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。在这种实验中，恶性肿瘤细胞具有贴壁生长和悬浮生长的能力，通过软琼脂中形成克隆的能力反映了其恶性程度，因此可以用于细胞分化的基础研究以及评估临床肿瘤治疗的疗效等方面。 配制1.2%和0.7%琼脂，高压灭菌； 将1.2%琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板底部，37°C孵育30分钟使其凝固； 将单细胞悬液与0.7%琼脂混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。加入培养基后，每3天更换一次； 孵育2-3周后，使用显微镜观察克隆的大小，并拍照。如果拍摄整个孔，可在每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色，37°C过夜后拍照； 统计与分析：计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）*100%。    

新手如何做好ELISA实验? 这个问题问得好，她会得到满意的检查结果吗？ 以及应该注意哪些预防措施？ 让我们看看 ELK 实验室录制的视频。

高背景/非特异性染色 结果描述   可能的原因 建议及预防措施 终止后,整板结果显现均一的黄色或淡色;或标曲有线性但背景过高 整版发黄现象可能由于错加其他试剂造成 实验前检查试剂的组分及批号,确认所有组分均属于对应的试剂盒.不同试剂盒或不同批号 未充分清洗酶标板 确保清洗过程中每个微孔所加入洗涤液量一致.清洗完成后,将酶标板用力按压在吸水纸上,以除去残余的缓冲液. 孵育时间过长 请严格按照说明书步骤操作 酶标记物污染了吸头及盛放显色剂容器或阳性对照污染了微孔 吸取不同的试剂时应更换吸头,配置不同的试剂组分时,应使用不同的储存器皿,操作时请使用移液器 检测抗体货Avidin-HRP的浓度过高 检查浓度计算是否正确或进一步稀释后再使用 底物在使用前曝光或污染 加入底物前,应始终避光保存 显色时间过长 请严格按照说明书步骤操作 读取了吸光值时使用了错误的滤光片 TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值,并以650nm作为校正波长   白板 结果描述   可能的原因 建议及预防措施 显色步骤结束后,酶标板所有孔均无颜色;阳性对照不明显 组分试剂混淆使用 配制或使用时应看清楚标签 洗版及加样过程中,酶标物受污染失活失去催化显色剂显色的能力 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂(如NaN3等),确认配制洗液的容器已洗干净. 遗漏了某种试剂或某个步骤 详细审阅说明书,并严格遵循操作步骤   显色淡 结果描述   可能的原因 建议及预防措施 包括标曲、样本在内的所有板孔颜色均较淡 试剂盒超过有效期或储存不当 请在有效期内使用,并按照说明书推荐的保存条件保存,避免污染 试剂、样品用前未平衡 所有试剂、样品应置室温平衡30min左右 移液器吸量不足,移液抽吸排放太快,吸头内壁挂液太多或内壁不清洁 校正移液器,吸头要配套,每次吸头要吻合紧密,移液不宜过快,排放应完全.吸头内壁要清洁,最好一次性使用. 孵育反应时间不足 定时器准确定时 显色反应不足 一般在15-30min 洗涤次数增加,浓缩洗液稀释倍数不符合要求 减少洗涤冲击力,按照说明书要求稀释浓缩洗液、洗涤时间,准确记录洗涤次数及用量 蒸馏水水质有问题 配置好的洗液一定要检测PH值是否呈中性 洗板及加样过程中,酶标物受污染失活而失去催化显色剂显色的能力 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂(如NaN3等),确认配制洗液的容器已经洗干净,确认配置洗液的纯化水达到要求且未受污染. 标曲正常,样本显色较淡 样本使用NaN3防腐剂,抑制了酶的反应 样本不可使用NaN3   待测样本中可能不含强阳性标本,故结果可能是正常的 如有怀疑,可以复检 目测结果正常,但酶标仪读值偏低 读取吸光值时使用了错误的滤光片 TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值,并以650nm作为校正波长   标准曲线不佳/重复性不好 结果描述   可能的原因 建议及预防措施 重复性差 标准品配制有误 严格按照说明书标准品配制进行操作,仅使用推荐的稀释液对标准品进行稀释 试剂盒储存方法不当或储存环境太差 请在说明书推荐的条件下保存,不要将重悬后的组分在室温放置时间过长 过早稀释各工作组分 各工作组分请在使用前10分钟配置,并立即加入到微孔中 样本加入后未混匀 针对同时加入多种试剂组分,加样后在混匀器上充分混匀,注意稳拿稳放,防止外溅 酶标仪测定重复性差 校准酶标仪 孵育时间、洗涤条件、显色条件、操作人员不一致 重复测定标本,反应条件、人员等尽可能与上次保持一致 洗涤不正确 移液器准确加入200µl/孔洗涤液或注满各孔,但不要溢出.洗板机洗板时不应有堵孔,洗涤应充分 孵育温度恒温效果不好 保持温度恒定,避免局部温度过高过低 加液时,过多残留于孔壁上 加液时,吸头在不碰到孔底的前提下尽量沿着孔壁下方加液 耗材重复使用 吸取不同的试剂时应更换吸头,配置不同的试剂组分时,应使用不同的储液器皿 微孔底部被划伤或者存在污垢 操作时细心,注意不要触碰底部擦拭酶标板底部,以去除污垢或者指纹 阈值附近时阴时阳 同一样品做3个复孔,以2个(含2个以上相同结果为准) 加样时交叉污染 加标本时尽量避免交叉污染 出现随机性的花板、跳孔现象 手工洗板造成的交叉污染 手工洗板时前3次注洗液后应立即弃去,后几次再设定浸泡时间,可以减少交叉污染 拍板时交叉污染 拍板时用合适的吸水纸巾,不要把无关物质拍进板孔,并尽量不要在同一位置拍,以免交叉污染 洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大,造成花板、跳孔 疏通加液头,使洗板时每孔均注满洗液,吸液时残留量要小 样本离心处理不全,致使反应孔内发生凝血现象或存在沉淀物或残留细胞成分干扰 血清血浆应充分离心,3000rpm 6min以上 样品放置时间过长,污染 样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染 洗涤液配制有误或直接误用浓缩洗涤液 请按说明书配置