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ELISA实验室常见问题及原因分析
供稿：本站编辑
发布时间：2023-11-30
浏览量：408次
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高背景/非特异性染色
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结果描述
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可能的原因 |
建议及预防措施 |
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终止后,整板结果显现均一的黄色或淡色;或标曲有线性但背景过高 |
整版发黄现象可能由于错加其他试剂造成 |
实验前检查试剂的组分及批号,确认所有组分均属于对应的试剂盒.不同试剂盒或不同批号 |
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未充分清洗酶标板 |
确保清洗过程中每个微孔所加入洗涤液量一致.清洗完成后,将酶标板用力按压在吸水纸上,以除去残余的缓冲液. |
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孵育时间过长 |
请严格按照说明书步骤操作 |
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酶标记物污染了吸头及盛放显色剂容器或阳性对照污染了微孔 |
吸取不同的试剂时应更换吸头,配置不同的试剂组分时,应使用不同的储存器皿,操作时请使用移液器 |
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检测抗体货Avidin-HRP的浓度过高 |
检查浓度计算是否正确或进一步稀释后再使用 |
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底物在使用前曝光或污染 |
加入底物前,应始终避光保存 |
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显色时间过长 |
请严格按照说明书步骤操作 |
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读取了吸光值时使用了错误的滤光片 |
TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值,并以650nm作为校正波长 |
白板
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结果描述
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可能的原因 |
建议及预防措施 |
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显色步骤结束后,酶标板所有孔均无颜色;阳性对照不明显 |
组分试剂混淆使用 |
配制或使用时应看清楚标签 |
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洗版及加样过程中,酶标物受污染失活失去催化显色剂显色的能力 |
确认盛酶标的容器不含酶抑制剂(如NaN3等),确认配制洗液的容器已洗干净. |
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遗漏了某种试剂或某个步骤 |
详细审阅说明书,并严格遵循操作步骤 |
显色淡
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结果描述
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可能的原因 |
建议及预防措施 |
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包括标曲、样本在内的所有板孔颜色均较淡 |
试剂盒超过有效期或储存不当 |
请在有效期内使用,并按照说明书推荐的保存条件保存,避免污染 |
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试剂、样品用前未平衡 |
所有试剂、样品应置室温平衡30min左右 |
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移液器吸量不足,移液抽吸排放太快,吸头内壁挂液太多或内壁不清洁 |
校正移液器,吸头要配套,每次吸头要吻合紧密,移液不宜过快,排放应完全.吸头内壁要清洁,最好一次性使用. |
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孵育反应时间不足 |
定时器准确定时 |
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显色反应不足 |
一般在15-30min |
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洗涤次数增加,浓缩洗液稀释倍数不符合要求 |
减少洗涤冲击力,按照说明书要求稀释浓缩洗液、洗涤时间,准确记录洗涤次数及用量 |
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蒸馏水水质有问题 |
配置好的洗液一定要检测PH值是否呈中性 |
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洗板及加样过程中,酶标物受污染失活而失去催化显色剂显色的能力 |
确认盛酶标的容器不含酶抑制剂(如NaN3等),确认配制洗液的容器已经洗干净,确认配置洗液的纯化水达到要求且未受污染. |
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标曲正常,样本显色较淡 |
样本使用NaN3防腐剂,抑制了酶的反应 |
样本不可使用NaN3 |
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待测样本中可能不含强阳性标本,故结果可能是正常的 |
如有怀疑,可以复检 |
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目测结果正常,但酶标仪读值偏低 |
读取吸光值时使用了错误的滤光片 |
TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值,并以650nm作为校正波长 |
标准曲线不佳/重复性不好
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结果描述
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可能的原因 |
建议及预防措施 |
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重复性差 |
标准品配制有误 |
严格按照说明书标准品配制进行操作,仅使用推荐的稀释液对标准品进行稀释 |
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试剂盒储存方法不当或储存环境太差 |
请在说明书推荐的条件下保存,不要将重悬后的组分在室温放置时间过长 |
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过早稀释各工作组分 |
各工作组分请在使用前10分钟配置,并立即加入到微孔中 |
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样本加入后未混匀 |
针对同时加入多种试剂组分,加样后在混匀器上充分混匀,注意稳拿稳放,防止外溅 |
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酶标仪测定重复性差 |
校准酶标仪 |
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孵育时间、洗涤条件、显色条件、操作人员不一致 |
重复测定标本,反应条件、人员等尽可能与上次保持一致 |
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洗涤不正确 |
移液器准确加入200µl/孔洗涤液或注满各孔,但不要溢出.洗板机洗板时不应有堵孔,洗涤应充分 |
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孵育温度恒温效果不好 |
保持温度恒定,避免局部温度过高过低 |
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加液时,过多残留于孔壁上 |
加液时,吸头在不碰到孔底的前提下尽量沿着孔壁下方加液 |
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耗材重复使用 |
吸取不同的试剂时应更换吸头,配置不同的试剂组分时,应使用不同的储液器皿 |
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微孔底部被划伤或者存在污垢 |
操作时细心,注意不要触碰底部擦拭酶标板底部,以去除污垢或者指纹 |
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阈值附近时阴时阳 |
同一样品做3个复孔,以2个(含2个以上相同结果为准) |
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加样时交叉污染 |
加标本时尽量避免交叉污染 |
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出现随机性的花板、跳孔现象 |
手工洗板造成的交叉污染 |
手工洗板时前3次注洗液后应立即弃去,后几次再设定浸泡时间,可以减少交叉污染 |
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拍板时交叉污染 |
拍板时用合适的吸水纸巾,不要把无关物质拍进板孔,并尽量不要在同一位置拍,以免交叉污染 |
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洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大,造成花板、跳孔 |
疏通加液头,使洗板时每孔均注满洗液,吸液时残留量要小 |
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样本离心处理不全,致使反应孔内发生凝血现象或存在沉淀物或残留细胞成分干扰 |
血清血浆应充分离心,3000rpm 6min以上 |
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样品放置时间过长,污染 |
样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染 |
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洗涤液配制有误或直接误用浓缩洗涤液 |
请按说明书配置 |
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